稳转株筛选与鉴定

制备稳转株的实验步骤

一．准备及预实验

1、确定细胞系相关信息：需包括如下内容

细胞系名称

细胞培养条件

细胞增殖速度

支原体污染情况

2、查阅慢病毒感染该细胞的MOI值

3、预实验确定筛选药物用量：

（1）查阅Puromycin/Blastincidin在目的细胞中稳转株筛选的致死用量信息；参考查阅得到的数据，确定3个药物浓度梯度（如没有相关信息，则需将药物浓度梯度范围增大，数量增多至6个）；

（2）D0将细胞铺于6孔板中，使D1细胞融合度约90%；D1按（1）中设置的药物梯度，加入药物；

（3）D4换液，并重新加入药物；

（4）D7观察，找到致死率100%的孔，该孔使用的药物浓度，即为药物筛选浓度。

二．稳转株筛选及构建

注：以下实验参数，按1株稳转株为例描述，实验需考虑有无对照稳转株！

1、细胞铺板：D0将细胞接种于6孔板中（4个孔），使D1细胞融合度约70%

病毒感染：

2、慢病毒上清：分别弃去6孔板中3个孔的0.5毫升培养基、1毫升培养基、2毫升培养基和，分别加入2毫升慢病毒上清、1.5毫升慢病毒上清和0.5毫升慢病毒上清；

3、纯化慢病毒：选3个孔，并可按推荐MOI、大于此MOI及小于此MOI，共三个MOI值，添加慢病毒；

4、观察感染效率：感染后72小时，观察感染效率，效率高于80%最佳，最低不应低于40%，选择1-2个感染效率较好的孔。

5、筛选：

(1)多克隆稳转株：从感染72小时后开始于6孔板中加筛选药物，每隔2天，重新换液加入药物。药物筛选需至少持续14天，直至显微镜下观察荧光细胞比例为100%。

注：第一次加入药物时在上午进行，4-6小时后观察细胞状态，如细胞死亡过多，需更换新鲜不含药物的培养基。

(2)单克隆稳转株：建立在获得多克隆稳转株基础上。

A、有限稀释法：

a.取24个1.5毫升EP管，每管中加入800毫升完全培养基；

b.用胰酶将多克隆稳转株消化（90%融合度，10毫升培养基终止消化），取80微升至第一个EP管中，混合均匀；

注：应使用1000微升枪尖，混合时不要过度吸打，以免破坏细胞。

c.从第一个EP管中取80微升至第二个EP管中，混合均匀，以此类推。

d.将EP管中的细胞悬液，以每孔100微升，接种于96孔板中；

e.过夜培养后，观察第12-24列，寻找只含有1个细胞的孔，并做好标记；

f.培养3-4周，待标记孔中细胞扩增后，消化传代扩增，即为单克隆稳转株细胞。

注：培养的第一周不要换液，接下来每3-4天换液。

B、平板挑取法

a.计数100个多克隆稳转株细胞，接种于一个10cm培养盘中；

注：尽量吹打均匀，防止细胞聚团。

b.过夜培养后，观察并寻找单个细胞的位置，并在盘底做标记；

c.培养2周；

注：培养的第一周不要换液，接下来每3-4天换液。

d.待标记处的细胞扩增为肉眼可见的白点，使用10微升移液器，调至最大量程，在尖端吸取一点胰酶（约5微升，且尖端为空气），缓慢滴至白点处，保持枪尖静置在白点上，且不让胰酶留出白点所在范围，1min后，迅速吹打，将消化下的细胞转移至96孔板中，传代扩增，即为单克隆稳转株细胞。约需2-3周。