浅析COIP的正确操作步骤！小编来带你了解一下！

　　浅析COIP的正确操作步骤！小编来带你了解一下！
　　一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）
　　1.取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。
　　2.37℃孵育10min。
　　3.终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450ul2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。
　　4.吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
　　5.细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm5min收集细胞。
　　6.倒去上清。按照细胞量，加入SDSLysisBuffer。使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。这样每100ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4x106个细胞。因此每管加入400ulSDSLysisBuffer。将2管混在一起，共800ul。
　　7.超声破碎：VCX750，25%功率，4.5s冲击，9s间隙。共14次。
　　二、除杂及抗体哺育（第一天）
　　1.超声破碎结束后，10000g4℃离心10min。去除不溶物质。
　　2.留取300ul做实验，其余保存于-80℃。
　　3.300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M），65℃处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
　　4.在100ul的超声破碎产物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50xPIC。
　　再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1h。
　　5.1h后，在4℃静置10min沉淀，700rpm离心1min。
　　6.取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。
　　三、检验超声破碎的效果（第一天）
　　1.取100ul超声破碎后产物，加入4ul5MNaCl，65℃处理2h解交联。
　　2.分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
　　四、COIP免疫复合物的沉淀及清洗（第二天）
　　1.孵育过夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转2h。
　　2.4℃静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。
　　3.依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4℃颠转10min，4℃静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。
　　洗涤溶液：
　　（1）lowsaltwashbuffer-onewash
　　（2）highsaltwashbuffer-onewash
　　（3）LiClwashbuffer-onewash
　　（4）TEbuffer-twowash
　　4.清洗完毕后，开始洗脱。
　　洗脱液的配方：100ul10%SDS，100ul1MNaHCO3，800ulddH2O，共1ml。
　　每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
　　5.解交联：每管中加入20ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M）。
　　6.混匀，65℃解交联过夜。
　　五、DNA样品的回收（第三天）
　　1.解交联结束后，每管加入1ulRNaseA（MBI），37℃孵育1h。
　　2.每管加入10ul0.5MEDTA，20ul1MTris.HCl（PH6.5），2ul10mg/ml蛋白酶K。45℃处理2h。
　　3.DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。